J Med Virol︱刘晓平/陈云雨团队发表新冠病毒主蛋白酶多功能荧光底物制备的新策略

撰文︱陈云雨, 刘晓平

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

目前，新冠病毒奥密克戎变异株的全球蔓延导致了COVID-19确诊病例数再度激增，其具有载毒量大、传染性高、传播速度快、代际间隔短、传播隐匿和免疫逃逸等特点，为全球疫情防控带来了巨大挑战，积极开发新型广谱抗冠状病毒药物刻不容缓。

新冠病毒主蛋白酶（main protease, Mpro）在调控病毒RNA复制与免疫逃逸过程中发挥了重要作用，且人体缺乏其同源蛋白酶，这使Mpro成为广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一[1,2]。目前主要使用荧光共振能量转移法和荧光偏振法进行Mpro小分子抑制剂的高通量筛选，但在上述筛选方法中普遍使用以复杂化学合成工艺制备的高纯度荧光多肽作为Mpro底物，因其具有不稳定性且需要荧光分子标记等特点，导致其在大规模高通量筛选中产生筛选成本高、假阳性率高和稳定性差等缺点[3-5]。因此，积极开发稳定、经济和灵敏的新型Mpro底物具有重要意义。

2022年11月24日，皖南医学院刘晓平教授与陈云雨副教授团队在Journal of Medical Virology（IF=20.693）发表了题为“Production of a versatile SARS-CoV-2 main protease biosensor based on a dimerization-dependent red fluorescent protein”的研究论文。该论文利用基因工程技术，巧妙地设计了基于二聚化红色荧光蛋白（dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP）策略的新冠病毒Mpro荧光底物，具有稳定、经济、灵敏等优点，进一步提高了抗新冠病毒药物药理学活性评价的可靠性，具有重要的应用价值。

研究者利用大肠杆菌原核表达技术，成功地制备了新冠病毒Mpro荧光底物ddRFP。在本实验方案中，淬灭态的RFP-A₁与无荧光的RFP-B₁通过连接肽（AVLQS）形成具有强荧光特性的异源二聚体。活性化合物抑制Mpro对连接肽的切割作用，表现较高的荧光值（relative fluorescence unit, RFU）；非活性化合物不能抑制Mpro对连接肽的切割作用，可水解ddRFP产生淬灭态的RFP-A₁与无荧光的RFP-B₁，表现较低的RFU值。研究者通过联合应用荧光动力学检测法和电泳法即可准确地评价化合物对Mpro酶活性的体外抑制作用（图1）。荧光动力学和电泳法实验表明，Mpro对ddRFP具有良好的水解作用，但新冠病毒木瓜样蛋白酶（papain-like protease, PLpro）对其未表现出明显的水解作用，说明ddRFP具有良好的底物特异性。与传统的荧光多肽底物相比，ddRFP具有更好的稳定性和灵敏性。研究者基于ddRFP的理化特性，联合应用荧光动力学检测法和电泳法证实了奈玛特韦和二鹅掌菜酚在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用，但依布硒啉是非特异性Mpro抑制剂，与文献报道基本一致[5-8]，说明了本研究制备的ddRFP具有良好的稳定性、灵敏性、可靠性和多功能性。

图1. 新冠病毒Mpro荧光底物ddRFP的设计原理与应用

（图源：Yan H, et al., J Med Virol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究利用大肠杆菌原核表达技术成功地制备了新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP，有效弥补了传统药理学活性评价方法的不足，进一步提高了抗新冠病毒药物筛选与评价的可靠性，具有重要的应用价值。但不同连接肽形成的ddRFP可能具有不同的二级结构，进而导致迥异的底物特异性与转换数。因此，还需进一步优化连接肽序列以提高荧光底物的特异性和水解效率，具体的实验优化方案仍有待进一步研究。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jmv.28342

皖南医学院药理学硕士生闫浩浩、张锐和闫干干为论文的共同第一作者，刘晓平教授和陈云雨副教授为论文的共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金、安徽省自然科学基金、安徽省高等学校自然科学研究项目、安徽省重点研究与开发计划项目和皖南医学院青年骨干人才项目的资助。

第一作者：闫浩浩（左1），张锐（左2），闫干干（中）；通讯作者：刘晓平（右2），陈云雨（右1）

（照片提供自：刘晓平/陈云雨团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

刘晓平，皖南医学院研究生学院院长、教授、硕士生导师、皖南医学院科技创新团队负责人。2007年毕业于安徽医科大学药理学系获医学博士学位，主要从事生化与分子药理学研究。刘晓平教授主持了国家自然科学基金、安徽省高等学校自然科学研究重大项目和安徽省重点研究与开发计划项目等多项科研项目，代表性论著主要发表在J Med Virol、Eur J Med Chem、Cell Biosci、Bioorg Chem、Anal Biochem、Front Pharmacol、Phytomedicine、Phytother Res、Life Sci、《生物工程学报》和《药学学报》等杂志。

陈云雨，皖南医学院副教授、硕士生导师、中国药理学会化疗药理专业委员会青年委员会委员、《中国现代应用药学》第九届编委会青年编委。2015年毕业于北京协和医学院（清华大学医学部）微生物与生化药学系获医学博士学位，主要从事抗感染药物药理学和微生物与生物技术药学研究。自COVID-19爆发以来，研究团队针对新冠病毒蛋白酶抑制剂高效筛选中的关键技术问题，首次建立了以荧光偏振高通量筛选模型为核心的系统性筛选与评价方法，并发现了若干天然产物来源的新型先导化合物，已在J Med Virol、STAR Protoc、Virology、Cell Biosci、Anal Biochem、《生物工程学报》和《药学学报》等杂志发表了多篇研究论文，并申请国家发明专利2件，助力了荧光偏振技术的发展。虽然我们的实验条件非常有限，但基于本实验室在抗病毒药物筛选与评价方面的研究基础，我们乐于为全国同行无偿提供蛋白酶抑制剂筛选与评价服务，通力协作，协同攻关，为科技抗疫贡献绵薄之力。如有任何需求或意愿，欢迎您随时联系陈云雨博士（[e-mail]）!

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Zhu W, Shyr Z, Lo DC, et al. Viral proteases as targets for coronavirus disease 2019 drug development. J Pharmacol Exp Ther, 2021, 378(2): 166-172.

[2] Cannalire R, Cerchia C, Beccari AR, et al. Targeting SARS-CoV-2 Proteases and Polymerase for COVID-19 Treatment: State of the Art and Future Opportunities. J Med Chem, 2022, 65(4): 2716-2746.

[3] Zhu W, Xu M, Chen CZ, et al. Identification of SARS-CoV-2 3CL protease inhibitors by a quantitative high-throughput screening. ACS Pharmacol Transl Sci, 2020, 3(5): 1008-1016.

[4] Zhang J, Yan H, Yan G, et al. Protocol for high-throughput screening of SARS-CoV-2 main protease inhibitors using a robust fluorescence polarization assay. STAR Protoc, 2022, 3(4): 101794.

[5] Yan G, Li D, Lin Y, et al. Development of a simple and miniaturized sandwich-like fluorescence polarization assay for rapid screening of SARS-CoV-2 main protease inhibitors. Cell Biosci, 2021, 11(1): 199.

[6] Owen DR, Allerton CMN, Anderson AS, et al. An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science, 2021, 374(6575): 1586-1593.

[7] Ma C, Hu Y, Townsend JA, et al. Ebselen, Disulfiram, Carmofur, PX-12, Tideglusib, and Shikonin Are Nonspecific Promiscuous SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitors. ACS Pharmacol Transl Sci, 2020, 3(6): 1265-1277.

[8] Milligan JC, Zeisner TU, Papageorgiou G, et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of Nsp5 main protease. Biochem J, 2021, 478(13): 2499-2515.

本文完